细胞信号转导通路活化、磷酸化蛋白、膜电位、钙流及PH值等检测的研究广泛涉及到免疫学、药理学、细胞学、病理学、组织胚胎学、蛋白质组学，病毒学等领域。流式细胞仪可以通过检测相应活化蛋白或生物学事件的特异性荧光探针信息，实现对该生物事件的检测，从而对细胞功能实现深入的分析。 

细胞内或细胞核内染色结合流式细胞术分析是确定某些细胞内细胞因子或蛋白表达水平的一种简便快捷的方法。流式细胞术分析细胞内或细胞核内抗原的关键在于要使荧光标记的单克隆抗体能自由进入细胞内或细胞核内，却不能破坏细胞性态的完整性和保持细胞内把抗原结构不变。因此，与细胞表面抗原的检测和分析相比，检测胞内或细胞核内抗原的主要区别在于细胞固定（保持细胞形态的完整性）和使胞膜或核膜穿透（使荧光标记的单克隆抗体能自由进入）。

细胞因子是指由免疫细胞（如T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、单核/巨噬细胞等)和某些非免疫细胞(如内皮细胞、表皮细胞、成纤维细胞、骨髓及胸腺基质细胞等)经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质，多属相对分子质量为6000-60000的多肽或糖蛋白。细胞因子通常包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、造血因子、趋化因子、各种细胞生长因子等。细胞因子通过与靶细胞膜表面的特异性受体相结合，在体内广泛参与免疫应答及调节、促进组织修复、刺激造血功能、刺激细胞的增殖与分化、参与细胞凋亡等重要生理活动；某些因素可导致一些细胞因子的表达或功能异常，从而参与炎症反应、免疫性疾病、肿瘤性疾病等病理过程的发生与发展。

检测活化免疫细胞内的细胞因子，对于研究分泌细胞因子的细胞类型、产量，所分泌细胞因子的种类和评价细胞免疫功能等具有重要价值。流式细胞术检测胞内细胞因子是用多种不同荧光标记的细胞因子和细胞膜抗体进行联合标记，可以在单细胞水平上同时检测同一细胞亚群产生的不同细胞因子，不但能了解细胞因子的产量和产生该细胞因子的细胞种类，而且能了解细胞内细胞因子产生的动力学原理。

在流式细胞术中，细胞表面分子的检测与分析占重要地位。细胞在分化的不同阶段以及活化过程中，其细胞膜表面可表达供鉴别的特殊结构，即表面分子，也称表面标志。利用荧光素标记单克隆抗体，可对这些细胞表面标志进行流式细胞术检测，进而分析细胞的种类、亚类以及功能特性。流式细胞术在细胞表面分子的检测与分析中主要应用于： 

①免疫细胞及其亚群的检测与功能分析：包括检测样本中T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞以 及DC细胞等细胞的比例，检测免疫细胞的细胞活性水平等。 ②血液系统疾病细胞表面标志的研究与临床应用：目前已将淋巴细胞亚群的分类方法引申到血液系统疾病的研究、分类和诊断上。用该技术对白血病细胞进行免疫分型，可以更多地了解这些疾病 的生物学特征，提供更合理的免疫诊断方法，如多色流式细胞术检测外周血单个核细胞中的各淋巴细胞及其亚群。

细胞周期与细胞增殖与生物体功能有着密切的关系，如肿瘤的发生、增殖和转移、胚胎的有序发育、成熟机体的健康、组织的再生及衰老都与细胞周期密切相关。某些细胞周期蛋白基因本身就是原癌基因。流式细胞仪是细胞周期研究的最有效的工具之一，流式细胞仪对DNA、RNA 含量及细胞周期的分析具有独特的特点:<br/>（1）测定细胞内DNA 变异系数小，一般为1 %～3 %；（2）可正确分辨二倍体、四倍体、近二倍体及非整倍体，准确进行细胞周期分析；（3）分析数据多、统计结论可靠；（4）分析结果直接以图形形式显示，形象直观。

流式细胞仪对细胞周期的分析主要是对单个细胞内DNA 含量的分析，通过标记DNA发出荧光的强弱可推算出G0、G1 期(二倍体)、S期(超二倍体)、G2/M 期(四倍体)的比例了解细胞的增殖状态。一般来说，高S相比率代表高增殖指数的细胞。

细胞凋亡是机体生长发育、细菌分化和病理状态中细胞死亡的过程, 凋亡典型的形态特征是核染色质固缩并分离, 细胞质浓缩, 细胞膜和核膜皱曲, 核断裂形成片段, 最后形成数量不等的凋亡小体。流式细胞术可以进行DNA含量分析, 通过二倍体细胞G0/G1期峰前的亚二倍体峰来确定。在凋亡早期, 一些与膜通透性改变及凋亡有关的蛋白在细胞膜表面有特定表达, 通过流式细胞仪结合单克隆体可以检测表达这些蛋白的细胞，从而确定细胞的凋亡情况。细胞凋亡与信号转导是生命科学和医学领域研究非常广泛的方向之一，通过特异性抗体对凋亡分子与各信号转导通路中的蛋白分子进行标记，可发现新的凋亡相关分子和新的信号通路分子，对细胞凋亡机制的研究有着重大的意义。   

传统方法从外周血分离单核细胞一般经过反复离心清洗，造成了大量细胞损失，如需获取纯度较高的单核细胞，则需要进一步利用抗体、磁珠等技术加以纯化，不仅实验成本较高，且获得的单核细胞容易被激活而影响实验结果的准确性。

基于流式细胞仪的分选功能，根据细胞的大小以及颗粒度等特征，对白细胞直接进行分选获取人外周血中的单核细胞的方法，既避免多次重复离心，又能分选得到纯度在80％-90％之间的单核细胞用于后续实验，为深入研究单核细胞提供了良好的技术平台。

该方法特别适合含量稀少、比较珍贵细胞的分离。应用流式细胞分选仪分离中性粒细胞，保证阳性细胞高收集率的同时兼顾纯度，经进一步实验验证纯度可达99％，且分离时间较短。从脾脏或胸腺中分选目的T细胞亚群，分选纯度达98％以上，分选活性好，为后续工作的开展提供了高纯度高质量的细胞。

肌卫星细胞是骨骼肌组织内最主要的干细胞成分，因其位于肌纤维细胞膜和基底膜之间而得名，它不仅负责肌组织的生后生长发育，更是骨骼肌损伤再生的主要细胞来源；正常生理情况下肌卫星细胞多处于静息状态，在损伤等病理生理刺激下可迅速活化为具有增殖能力的成肌细胞并进一步分化；研究表明在肌肉老化进程中，肌卫星细胞数量逐渐下降，同时骨骼肌损伤后再生修复能力显著减退。

快速高效地获取高纯度的肌卫星细胞是研究其增殖分化及调控机制的重要前提。利用流式细胞分选技术并选用 CD45－/CD31－/Sca1－/α7-integrin+三阴一阳的分选方案分离小鼠骨骼肌卫星细胞并对分选细胞进行诱导分化培养，可快速、高效、高纯度的获取静止卫星细胞。  

单克隆抗体治疗可能是现代医学中最主要的治疗/诊断方法之一。目前单克隆抗体药物已经被批准用于治疗多种疾病。传统的单克隆抗体主要通过免疫小鼠B细胞同骨髓瘤细胞系融合的杂交瘤技术来获得，但将鼠源单抗用于临床治疗有诸多弊端，如人体对鼠源单抗作为外源蛋白的有害免疫效应发病率较高，同时人体免疫系统对于鼠源抗体缺乏足够的效能。戊型肝炎是由戊型肝炎病毒所引起的病毒性肝炎，已逐渐成为全球范围内引发急性病毒性肝炎的最主要原因之一。

戊型肝炎病毒感染在许多发展中国家是一个严重的公共卫生问题。通过应用抗原特异 IgG+记忆B细胞流式筛选平台，采用 CD20+、CD27+、IgG+和抗原这四个指标，对戊型肝炎病毒疫苗接种者PBMC中的戊型肝炎病毒特异IgG+记忆B细胞进行分选。通过单细胞RT-PCR的方法获得戊型肝炎病毒衣壳蛋白特异性抗体序列，并进行真核重组表达，最后对获得的人源单克隆抗体进行性质鉴定，为后期研究疫苗在免疫人群体内抗体的演化过程打下基础。

人源单克隆抗体在临床上也有多方面的应用，如体内定位诊断、免疫调节、感染性疾病和肿瘤的治疗等。随着肿瘤免疫治疗研究的逐渐深入，人源单克隆抗体应用范围不断拓展，市场需求也不断增加，通过建立基于流式细胞分选和单细胞PCR 技术的人源抗体筛选平台，能够高效地获得抗原特异性的人源抗体。因此，基于流式细胞分选及单细胞PCR技术的人源抗体筛选方法具有相当广阔的发展前景和开发价值。

间充质干细胞是干细胞家族的重要成员之一，具有多向分化潜能，如分化为脂肪、骨、软骨、肌肉等多种组织细胞，是用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复等的理想种子细胞，可在临床应用于解决多种血液系统疾病、心血管疾病、神经系统疾病、膝关节半月板部分切除损伤修复等。间充质干细胞以CD73+CD90+CD105+等为生物标志物，分选后的间充质干细胞纯度可在90%以上，在体外培养呈克隆性增殖。间充质干细胞具有的强大增殖能力和多向分化能力、免疫调节功能、来源方便、异体排斥轻等特点，使其具有广阔的临床应用前景。

肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新、无限增殖及多向分化潜能的细胞，这部分细胞虽然只占少部分，但在肿瘤的发生、演进、复发、耐药及逃逸免疫系统的识别和清除过程中可能发挥了至关重要的作用。因此，建立有效的肿瘤干细胞分离方法，将有助于人们深入了解肿瘤的发病机理，从而建立新的有效的治疗方法。例如，虽然结直肠癌的治疗显著改善了结直肠癌患者的整体存活率，然而癌症转移的患者的治愈率仍然很低。转移性结直肠癌患者的临床治疗要综合考虑到疾病进展、治疗相关毒性、耐药性和患者的整体生活质量。尽管治疗取得了初步成功，但耐药性的发展可能导致癌症患者的治疗失败和复发，这可归因于肿瘤干细胞。因此，靶向结直肠癌肿瘤干细胞有助于治疗耐药，以及肿瘤的转移发展，使其成为治疗结直肠癌的潜在目标。肿瘤干细胞是重要的治疗靶点，然而其在正常组织中的比例非常的低。因此要对肿瘤干细胞进行深入分析，就需要首先对肿瘤干细胞进行分选富集，结直肠癌的肿瘤干细胞标记物包括CD133、Lgr5、Bmi-1、CD26和CD44v6等，富集方式可以选择流式细胞分选。

目前纯化细胞的方法主要是通过流式分选和磁珠分选。和磁珠分选方法相比，流式细胞分选仪具有纯度高、速度快、可多路分选、高通量等优点。磁珠分选的纯度一般只能达到90%，而流式分选纯度能达到99%。高速流式细胞分选仪的分选速度可达到数万个细胞每秒，并最大限度的保持样品的活性。对于稀有细胞的分选可一次获得海量的细胞。通过给液滴充以正、负不同的电荷，可调整液滴的偏转角度，实现多路分选，从而对几种特定细胞亚群进行高速分选纯化。另外，流式分选术可以在多孔板上进行样品收集。

分选侧群干细胞的研究增加了对干细胞增殖，纯化及发育调控机制的理解，同时还提供了一种从不同组织中分离纯化和利用多能干细胞的新策略，为组织工程和细胞治疗提供了新的干细胞材料来源。

 Hoechst33342是一种亲脂性DNA荧光染料，可以自由通过活细胞的细胞膜进入细胞内，与DNA结合，所以可以直接标记活细胞的DNA。干细胞能够通过ABC运输蛋白Bcrp1/ABCG2 将细胞内的Hoechst33342泵出细胞外，而其他细胞没有这种能力，所以用该染料标记时，干细胞染色较低，在流式图上能够明显区分与其他细胞。肝癌组织中可能存在具有表型和功能特殊的肝癌细胞, 分离和鉴定这群细胞是否具有干细胞特征对阐明肝癌发病机制、揭示肝癌复发和转移具有重要的意义。应用流式细胞分选术和Rho123染色, 分选细胞中具有原始干细胞特征的成体细胞，可以有效地分选出癌细胞中的肿瘤干细胞。类似的，在其他肿瘤中亦可通过特定的肿瘤干细胞的生物标志物对其进行富集。例如，采用流式细胞分选术从人乳腺癌细胞系MCF-7中分选CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞，并进行干细胞比例分析，用免疫荧光法检测、比较分选获得的细胞和对照细胞的干性和分化标记物的表达状态。

造血干细胞是血液系统中最原始的细胞，具有自我更新、自我维持并向多系分化与增殖的能力，一直是成体干细胞研究中的热点。造血干细胞具有自我更新能力，可以进一步分化，最终生成红细胞、白细胞和血小板等各种血细胞成分。造血干细胞研究是干细胞研究的重要组成部分，有助于白血病等各种血液系统疾病的治疗，具有重要的研究意义和广阔的应用前景。

但是造血干细胞仅占整个血液系统细胞群体中仅占很小的比例，应用流式细胞分选术分离和纯化就能很好的解决该问题，对于造血干细胞的功能研究具有重要意义。应用流式细胞分选术可以兼顾高回收率和纯度快速收集早期造血干细胞亚群，进一步建立培养以单个造血干细胞形成独立血细胞集落的实验方法。

在体模型中星形胶质细胞和神经元这些组织结合非常紧密，过去由于研究技术的局限，分开它们的方法很困难，应用流式细胞仪分选体外模型中神经细胞的技术方法，可以同时获得纯度高、数量多的不同种类的神经细胞。视网膜神经节细胞是视网膜内唯一连接脑部并将视网膜信息传递到大脑的神经元。

许多疾病可造成视网膜神经节细胞的损伤和死亡而导致永久性失明，如青光眼、糖尿病视网膜病变、脱髓鞘性疾病、肿瘤、视神经病变、缺血和外伤等。体外实验是深入研究视网膜神经节细胞损伤和保护机制的重要且不可或缺的手段，可以准确地研究其信号通路、基因表达、电生理特性等，因此建立高效、稳定的视网膜神经节细胞分离纯化方法显得极为重要。视网膜神经节细胞位于视网膜内层，占视网膜总细胞数量的不到1%，这也使其分离、纯化更加困难。流式细胞分选技术作为一种高效、迅速、稳定分选视网膜神经节细胞的方法，在得到较高纯度的视网膜神经节细胞的同时可以排除其他细胞对研究结果的干扰及影响，为视网膜神经节细胞的研究奠定了基础。

对用于体内动物模型的稳定转染细胞的获得，通过传统的脂质体转染、有限稀释法获得单克隆细胞株效率低；而通过体内传代，流式分选并单克隆化，是获得致瘤性好，体内体外稳定转染细胞株的一个可行方案。

利用逆转录病毒将非融合形式的绿色荧光蛋白GFP基因和目的基因稳定整合至靶细胞的基因组中，经过流式分选获得GFP阳性细胞，即为稳定表达目的蛋白的细胞株；该方法极大地提高了稳定细胞株的构建效率，同时该稳定细胞株的建立也为未知目的蛋白的功能研究提供了重要的研究工具。

随着精准医疗技术的发展，免疫细胞疗法正在成为肿瘤治疗的热点方向。嵌合性抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)经过几十年的发展完善，已经在临床上显示出巨大的应用前景。与传统的肿瘤治疗策略相比，CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤精准度高，而且不依赖于MHC 的限制性。近年来，在B细胞淋巴瘤等血液恶性肿瘤的治疗中取得了积极的进展。除了血液系统肿瘤中的应用，研究者也将此项技术积极应用于实体肿瘤的治疗，如神经母细胞瘤、胶质瘤、胰腺癌等。CAR-T细胞技术在非实体瘤的治疗中疗效更加明确，主要的成功案例集中在特异性靶向CD19分子的CAR-T，其能够有效的治疗B细胞恶性肿瘤(CD19+)，包括复发难治性急性B淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤等。

在CAR-T的治疗过程中，流式细胞仪具有广泛的用途。首先需要从患者身上分离T细胞，收集患者的外周血单核细胞（PBMC细胞)，可利用流式细胞分选术分离出特定的T细胞亚群，如CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+T细胞。其次，通过T细胞受体信号和CD28、4-1BB或OX40信号等共刺激信号产生主要的特异性信号，从而激活T细胞。再通过电穿孔、慢病毒或逆转录病毒载体，将CAR基因导入激活的T细胞中进行基因修饰，从而得到可表达CAR基因的CAR-T细胞。在此，流式细胞分选术可以分选纯化具有scFV CAR表达的T细胞。流式细胞分选术对细胞进行分离可以保证高纯度和维持细胞活力。最后，经流式细胞分选仪富集的CAR-T细胞的经过体外培养得到大量扩增CAR-T细胞。流式细胞术不仅在分选富集免疫细胞亚群起到了重要作用，也可以在CAR-T的治疗过程中，对CAR-T细胞的质量和患者的免疫状态进行监控。

总之，流式细胞分选术具有其自身特点及应用优势，随着其功能的不断完善，必将成为高等院校及科研机构在医学、生命科学、药学、食品及化学等众多学科实验教学、科研的重要技术手段；该技术在监测、检测、临床等领域亦会有更广泛、深入的应用前景。