嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T-cell,  CAR-T）疗法，作为一种前沿的基因工程个体化免疫疗法，利用患者自体T细胞，通过基因改造使其能特异性地识别并消灭肿瘤抗原阳性的细胞。

CAR的基本结构包括以下几个关键部分：单链可变区（scFv）或单域抗体（VHH）组成的胞外抗原识别区（Antigen-binding domain），负责特异性识别靶细胞。连接胞外识别区和胞内信号区的跨膜结构域（Transmembrane domain），稳定CAR受体在T细胞膜上的表达。胞内信号传导区，包括共刺激信号域（Costimulatory domain）和CD3ζ激活信号域（Signaling domain），负责激活T细胞功能。

Figure 1. CAR-T的结构与功能的关系

自2017年FDA批准首个CAR-T疗法Kymriah以来，该领域蓬勃发展，已成为治疗复发/难治性（R/R）血液肿瘤的关键手段，尤其在急性淋巴细胞白血病（ALL）、大B细胞淋巴瘤（LBCL）及多发性骨髓瘤（MM）等疾病中展现出显著疗效，多款产品已获批上市。

然而，尽管CAR-T细胞疗法疗效显著，但其临床效果存在个体差异，其中CAR-T细胞的结合动力学（cellular binding kinetics）是关键影响因素之一。近年来，流式细胞术凭借其快速、定量及高通量的优势，被广泛应用于研究CAR-T细胞与靶细胞间的相互作用，为评估CAR-T细胞的结合特性提供了有力工具。

CAR-T细胞的治疗效果不仅取决于其抗原识别能力，还深受细胞结合动力学的影响。结合动力学关注的是CAR-T细胞与靶细胞间相互作用的强度和持续时间，这一特性直接关乎CAR-T细胞的扩增能力、耐受性及其抗肿瘤效果。研究表明，不同CAR结构的细胞结合特性对其体内持久性、耗竭程度及肿瘤清除能力具有显著影响。

传统的CAR-T细胞功能评估主要依赖于杀伤实验和细胞因子释放分析，而流式细胞术则提供了一种直接测量CAR-T细胞结合效率的新途径，使研究人员能够更精确地评估CAR设计的优劣。

Shepherd等研究人员开发了一种基于流式细胞术的快速高通量检测方法，用来评估CAaR-T细胞和靶细胞的结合能力，更高效地筛选和优化CAR设计。

该方法利用荧光标记的CAR-T细胞和靶细胞，在流式细胞术平台上进行动态结合分析，以量化CAR-T细胞的结合能力。该方法通过短时间孵育CAR-T细胞与靶细胞，并检测结合形成的双阳性（double-positive, DP）细胞群，进而评估不同CAR结构的亲和力和结合特性。

Figure 2. 实验流程

3.1 细胞与试剂

3.1.1 生物材料

1. CAR-Jurkat细胞：稳定表达CAR的Jurkat细胞。

2. 靶细胞：表达特定抗原的肿瘤细胞，用于评估CAR-T结合能力，如：Ramos细胞。

3.1.2 荧光抗体

1. 根据CAR-T类型选择VHH或scFv特异性荧光抗体，用于识别CAR-T，如: AF 647 Anti-Alpaca IgG，PerCP通道。

2. CD45 或其他Jurkat/T细胞特异性抗体，用于识别免疫细胞，如:APC-H7 anti-Human CD45，APC通道。

3. CD19 或其他靶向特异性抗体，用于识别靶细胞，如:Anti-Human CD19，FITC通道。

3.2 实验流程

CAR-T细胞和靶细胞的制备。使用荧光染料分别标记CAR-T细胞和靶细胞，以便在流式分析中识别。

1 混合：将标记后的CAR-T细胞和靶细胞按照一定E:T（Effector:Target）比例混合（如1:1或5:1）

2 结合实验：在37°C孵育5-30分钟，以确保CAR-T细胞与靶细胞充分结合。

3 流式分析：孵育结束后，将细胞混合物上机进行流式分析。

4  门控策略：

a) FSC-A/SSC-A圈出活细胞；

b) FITC_CD19+ 圈出总CAR-T细胞（即靶效结合+非结合的CAR-T细胞总和）；

c) FITC_CD19+ 和PC5. 5+_scFv圈出双阳性细胞群（即靶效结合的双阳性细胞）。

d) 使用CAR特异性表面染色剂APC_CD45+混合FITC_CD19+，消除死细胞或细胞碎片的自发荧光影响；

e) 使用前向散射光FCS-H/FCS-W排除单细胞。

Figure 3. 圈门策略

5  数据分析

a) 计算结合率（Binding Rate）=DP细胞数 / 总CAR-T细胞数 × 100%

b) 使用制图软件绘制结合曲线（Binding-Dissociation Curve），比较同种CAR设计在不同ET比例下结合能力的差异。或者进行多组实验，分析不同CAR设计的结合特性。

Figure 4. 不同CAR的结合曲线示例

在CAR-T细胞研发过程中，研究其与靶细胞的结合动力学是优化CAR设计的重要环节。传统的表面等离子共振（SPR）和生物层干涉测量（BLI）技术作为无标记检测方法，广泛应用于分子水平的亲和力分析。SPR以其高灵敏度和重现性著称，能够实时测量分析物与配体的结合，并在低亲和力CAR筛选中发挥重要作用。然而，该方法成本较高，技术要求复杂。BLI作为新兴无标记技术，具备中等通量和高效筛选能力，但在检测灵敏度上仍逊色于SPR，且容易受到质量传递效应的影响。

相比之下，流式细胞术提供了一种更贴近生理环境的细胞水平检测方法。与SPR、BLI在分子水平上分析CAR-T结合不同，流式方法直接在活细胞上检测CAR-T与靶细胞的相互作用，更符合细胞生长的实际环境。此外，流式方法具有多重检测和高通量的优势，一次实验即可分析数百万个细胞，并且能够同时测量多个参数，为CAR-T检测提供更丰富的信息。更重要的是，流式方法具备单细胞分辨率，能够区分未结合、部分结合和完全结合的细胞群体，为CAR-T结合动力学研究提供更精确的解析。

未来，流式细胞术在CAR-T研发中的应用还可进一步拓展，如结合动态剪切力洗涤实验，直接评估CAR-T细胞的结合稳定性，为优化CAR结构提供数据支持，或者结合实时成像技术监测CAR-T细胞动态变化。

CAR-T细胞疗法的治疗效果受到多个因素的影响，其中CAR设计和靶效比（target-to-effector ratio，T:E）在结合效率和功能表现上起着关键作用。不同的CAR结构，包括胞外结构的亲和力、跨膜结构的稳定性以及胞内信号域的不同组合，都可能影响CAR-T细胞与目标抗原的结合动力学。这种结合效率不仅决定了CAR-T细胞的特异性程度，也影响其持久性和杀伤能力。此外，靶效比的不同也会导致CAR-T细胞在体外实验和临床应用中的表现存在显著差异，影响其抗肿瘤活性。

本文提出了一种基于流式细胞术的CAR-T结合动力学检测方法，利用荧光标记的靶细胞或抗原蛋白，量化不同CAR-T细胞的结合动力学。与传统的检测方法相比，该方法能够在更接近生理环境的条件下，直接检测CAR-T与靶细胞的相互作用动力学，具有多重检测高通量的优势，和单细胞分辨率水平。流式细胞术检测CAR-T结合动力学的方法，为优化CAR设计、提高T细胞活性及制定更精确的治疗方案提供了有效的工具，为CAR-T细胞治疗提供了一种高效、定量的验证方法，为未来的个性化细胞治疗策略奠定了基础。

Figure 7. SE420 流式细胞分选仪

在CAR-T研发中，实验设备的选择直接影响数据质量和研究效率。SE420流式细胞分选仪凭借其卓越的性能，成为CAR-T结合动力学研究的理想工具。

SE420流式细胞分选仪是一款功能强大的设备，支持最高5激光、3散射光和19荧光通道，可对CAR-T细胞进行高维度表征，实现对样本的全面分析。其外形设计经过优化，尺寸小巧，可轻松放入标准生物安全柜中，确保CAR-T研究在严格无菌的环境下进行。此外，SE420配备样本仓消毒模块，为CAR-T细胞实验提供更高的安全性，减少交叉污染风险，提高数据可靠性。其高精度的细胞分选功能，能够在动力学检测基础上，进一步分离特定结合状态的CAR-T细胞，为功能验证和后续实验提供纯净样本。

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